へのへの先生仮免中

やっぱ教授になるまで仮免中で行きます(なれるのか)、神経系の研究がメインです

最近ブログ書いてないからわすれた(い)・撮像はむしろ時間がかかる・クローニングを考える①(続くのだろうか。)

へのへの先生と書こうとしてなぜかホルホル先生ってかこうとしてた。

なんか色々進行している気がする。

 

今年前半はオンライン授業になってしまった。

もうなんだかなぁ、学校やめる学生の気持ちもわからんではない。

去年はZoomの録画機能を使って一気にライブ感でとったが、最後の方で失敗すると最初からやり直しするなかなかハードな所もあった。

今年はパワポでプレゼンテーションを録画、でやっているが、スライドごとにやり直せるのはありがたい。

通しで聞いているとライブ感はなくなってしまって、なんだろう、のり?が悪い感じは去年より感じる

まぁ授業にノリやライブ感がいるんでっか、って所はある。

アルツハイマー病の話なんだが、今年はちょっと研究的な余談を減らした。

自分の専門のところほどあまりマニアックにならないように注意しないといかん。

 

ApeというDNAのソフトウエアが復活していたので色々クローニング手段について勉強し直したりしていた。

制限酵素を使ってLigation

昔ながらの方法で色々酵素の配列を組み合わせるのが面白い。

昔はLigationの効率が超悪かったから苦労したなぁ、今の子はクローニングなにそれ受託でつくればいいんじゃない?とか言いそう

使ったこと無いけどそんな会社もある。値段設定不気味なほど安いな。

まぁ僕の人生プラスミドづくりで結構すり減らしてるけど、おもしろいんだよね、設計と作成、自分でやりたい派

【メリット(ないこともない)】

PCRにはエラーがつきまとうから、違うベクターにシーケンス済みの目的配列を入れたい場合、サイズがデカければでかいほど制限酵素による切り出しを(一部でも)利用したほうが、よい

ただ大きい配列になればなるほど設計が困難になる(使える制限酵素が内部配列とかぶってしまうから)。

この酵素組み合わせを使う、というクローニングポリシーをきっちり持ってオリジナルベクターを設計しておけば、一度クローニングした配列のタグ(標識)の切り替えがライゲーションできる。これはエラーの危険性とシーケンスの手間を省き、時間節約に重要な考え方と言える。

○人工遺伝子では重複配列(タンデムに同じ配列が繰り返される)が作れない大きな弱点がある。Compatibleな制限酵素配列を利用することで短い配列を複数もった高感度プローブが作れる場合がある。

例えばBamHI(G↓GATCCとBglI(A↓GATCT)を両端に設置した配列Aをクローニングする、この両者は元の配列は違うが、切断した断片は同じという特徴を持つ。

こんな感じのベクターBamHIーAーBglIIーXhoI(XhoIの部分の制限酵素はXhoIでなくてよい)をまずつくる

さて次にベクターを2パターンで切断する

1.BglIIとXhoI…BglII切断配列、XhoI切断配列を両端に持つプラスミドができる

2.BamHIとXhoI…BamHI切断配列-A-XhoI切断配列をもつフラグメントができる

1と2をライゲーションかけるとBglII配列とBamHI配列が結合する

ーBamHIーAー(ggatct)- A-XhoIというコンストラクトができることになる。

真ん中の配列は元の酵素では認識されない上に、6塩基というのはアミノ酸としても数えやすいということになる、コードしているのはグリシン、セリンと水溶性もあり扱いやすそうな配列で悪くない(ただ場合によっては配列の行動を制限しないように、リンカー配列はより長く取る必要がある)。

3.できた配列は2のようにBamHIとXhoIでフラグメントを切り出すことができる。

→1.と同じベクターに3.由来のフラグメントを混ぜれば

ーBamHIーAー(ggatct)- A(ggatct)ーA-XhoI

となっていく。

これを何回か繰り返すと多重に同じ配列をもっているものを作れることになる。

 

他にも色々ありそうだが、まぁこの手法使わないと入れられないshRNAベクターとか色々あるのも事実

ライゲーションは昔より効率は良くなっているが、まぁフラストレーションは溜まる。

 

明日はGatewayでも紹介してみるか。