カエルらないオタマ達・燃やしたい・shRNAを考えるpublic TRC portal・遺伝子の表現型をさぐれCellular phenotype・実験は続くよどこまでも

お盆を過ぎて、池のおたまじゃくし（まだ言ってる）がどうなってるのか見に行ったら、絶賛おたまじゃくししてました。

カエルになったら負けでござる

的な何か。

超どうでもいいですな。

実家には母が一人暮らしをしていますが、私自身はあまりカエル、ええい帰る予定もなく、住人いなくなったらどうしようかねぇ、って話を姉貴たちとしてました。

誰が言い出したか、燃やそう、って話で盛り上がりました。

元ネタは多分月と６ペンスの最後のシーン

結構な私有地もあるんですが、なかなか運用も難しいところがあります。

基本山だし。

どうも膝など全般的な調子が良くなく、８時か９時頃には帰宅するイージーモードで仕事をしています。

なんだかんだ、幾つか実験案も浮かんだので、目的遺伝子のshRNAベクターを作ろうと文献を漁っていました。

トレンドはCas9なのですが、色々というか単一な事情で滞っています、ちくしょう。

まぁｓｈRNAにはまだまだ旨味はあるかなとも思います。

自分で設計することもできますが、論文で使われている配列だと信頼出来ます。

こういう場合はpubmedよりはHighwireの方が検出の勝手が良く、目的遺伝子＋shRNAとかで検索します。

ところが論文に言われているシーケンスをるんるんコピペしたらチミン（T）が５つ続く配列が・・・

shRNAに使用する短鎖RNAを細胞に作らせるためのプロモーターH1やU6はTが４つ続くとそこで合成終了するため、論文の通りに作ったら機能しないshRNAが出来ることになります。

ちょっと微妙な気分になりました、多分何らかのミスだけど、こういうのは指摘するべきなんだろうか。

そんな訳で論文に使われていた配列を使うのをあきらめて、RNAi consortium内のPublic TRC portalの配列を使うことにしました。

じゃぁ永遠の恋人（けしてやらないという意味）LRRK2いってみましょうか。

結果はこんな感じでござる。

目的によってはCDSを狙うか、３UTRを狙うかのバリエーションが役に立つ。

CDSはValianceはないだろうという効率の安全性が考えられるが、３UTRなら、３UTRを持たない発現ベクターでレスQできる可能性が出て来る。

一番上のCloneIDをつついてみると、この配列の特異性を調べることができます。

マウスまで調べてくれる。

LRRK2ではなかったですが、このデータベースではHuman マウス両方に効く配列等出て来るケースも多く（狙ってる？）一粒で二度美味しい配列も見つかるかもしれません。

ターゲット配列について、自分の持ってるベクターに合わせて設計しなおして仕上げを御覧じろ。

そんなDatabaseを検索してたら、Cellular phenotypeってDatabaseを見つけたので遊んでみました。

基本Knockdownで出て来るデータ。

色々検索してみたのですが、表現型が出るものは多くない。

思いついて昨日出てきたANK1を試してみました

かなり分泌障害が出るような表現型、ふむ面白いのではないか。

ひと通り昨日出てきた遺伝子を検索すると、結構あたりもあり、やはり面白そうな遺伝子達ではある。

Bin1・・・

まぁ神経細胞で同じ事起こってるかは話は別。

お盆前にGST pulldowｎをやって、大体目的とする配列を絞り込むことに成功しました。

もう一本くらい論文書けそうだな。

一方でコントロールのビーズに非特異に結合するものも出てきたため、論文的にはBackgroundを減らした実験を剃る必要が出て来ました。

ざっと見た感じ、溶解Bufferに１０％グリセロールを加える、BSAを加える等のプロトコルが出てきたので、グリセロールを試すことにして、１％CHAPSの他に0.1％Triton100を加えて見ました。

さて再実験したけどどうなることやら。