まぁ盛り下がってまいりましたー
雑誌からは連絡来ないし、腰痛いし、なんかDNAワークはうまくいかない。
最近なんかうわっ滑りしてたしなぁ、寒いのは外か私の文章か
躁があったら鬱もあるわな。
良かった探しをしよう
ねぇや、どうしようか。
だらだらと書いてみるか
そういえば大腸菌なぜかBL21にするとコロニーが生えないという問題にあたり、２７℃で一晩飼ってみると元気なコロニーを得られた。
それを３７摂氏にしても殖えないが２７摂氏なら増える。
最近人工遺伝子とかで調整してたから忘れていたけど、リコンビナントは結構繊細で、毒性を発揮する場合大腸菌の生育が悪くなるんだった。
今回のは哺乳類用配列で作ったせいもあるのかもしれない。
増えた大腸菌を１８℃で一晩振ったらちゃんとGSTタンパクが精製できたから、じつはあんまり苦労せずに出来たほうだったりする。
溶けなくて困ったって事は多かったけど、サルコシルを使う方法をとってから精製に関してはあまり問題が起こらなくなった。活性を持ってるかはまた別の話だが。
DH5αの方は元気はいいけど全くタンパクは精製されず、やはりBL21は偉大なのであった。
ｐDEST17と２７を間違えていて、まったくHisタグ付きのタンパクは発現ていなかった。
DEST17は大腸菌用、２７は哺乳類用、まぁ簡単にプレイバックは聞くから大丈夫なんだけど。
急遽D17に鬱し直して、発現チェックに入った。
まぁGatewayで写しただけだから入っているはずだ。
GSTとHis6ではまるで大きさが違うので、これは作らないといけない。
生理活性のある物が取れれば、少なくとも次の論文には使えるはずなのだ。
計算通りなら、色々臨床的にも学術的にも応用範囲が広そうなんだけど、絵に描いた餅はたぬき、なんじゃそりゃ、まぁそゆこと
最近プルダウンしかしてなくて、GST、の精製をやったことなかったのだけど、久しぶりにグルタチオン乖離から透析までのステップをやってみた。
タンパク量として全くみえなかったので、ダメかと思ったがダメ元でCBBで染色してみたら綺麗に精製はかかっていた、とにかく少ないだけらしい。
量の分かってるBSAをを横に流して定量するか、もしくはナノドロップでもはかれるのかもしれない。
ちょっとチェックしよう。
こいつに活性があればやる気二倍くらいにはなるので、ある系を起こして活性チェックに入った。
ゲノム改変はN細胞のみセレクションがうまくいっているようだ。
大分増えてきたので、明日くらいには分散してコロニーを取らないといけない。
B細胞はむしろ細胞死コントロールが生き残っているので、これ以上解析するか難しいところだ。
野望的に、Bは何とかしたいのだが。
報告書も春には書かんと、遠い先に見えて、書こうって時にデータ出しているわけにはいかん。
たぶん耐性遺伝子を発現する時間等必要なのかもしれないので、次回は遺伝子導入４８時間後にセレクションするか、新しく作ったHygromycinを試すか。
まぁN2aでそれほどやりたいことがあるか、という問題はあるが、やりやすい系があるのは重要だろう。
細胞がとれた時の確認のためのプライマーを設計せねば。
もう二三やってみたい遺伝子はあるが、セレクションと同定のろうもある
幾分頭の痛い所ではある。
一応内因性のタンパク質が消えることが目的なので、手持ちの抗体でHela、U87、B2C、N2a、BV2をすりつぶしたサンプルで内因性タンパク質が見えるかためしてみた。
悲しいことに、脳特異な遺伝子がHelaにもよく発現しているというよくある現象を確認したが、まぁ使えないこともなかろう。
なんともHelaはよくわからん細胞だと思う。平たくて愛らしい癒し系、ヒーラーだけに。
さむいよ。
物自体は高いというほどでは無いのだが、論文を確認すると、張り付きにくいというやや扱いにくさと、特別な培地が必要というやりきれなさが顔を表し、なかなか私をプッシュしない。
まぁやって悪くは無さそう、科研費をうならせるかどうか、もう唸るだけあるのか？
使ってみなければわからないもので、Infusionの断端は１５bpすべて平滑末端でないといけないと思い込んでいたのだけれど、別に突出末端でもOKであるとHPにちゃんと書いてあった。
若干むりな設計をしてしまったので、やり直すか、一度押し通してみるか迷うところだ。
PCRかけたからもうやるんだけど。
