グレンラガン見ましたすみません・足は大分直ったけど・Cas9・CRISPR考・ちょっと洒落たCAS9/CRISPRデザインソフトE-CRISP

グレンラガンを一気に最後まで見た、お前の血は何色だ、っていうかお前何歳？って感じ。

いやーでもすばらしいわあのアニメ、あれだけヒトが死ぬのに元気が出る。

真面目にDVD-box買おうか迷ったりした。

いまはどんなにかなーしくてなみだーがかれはててもー

とか思っている間に歩けるようになってきたので、意外に直るものだなぁと思う私の足

一方で、びっこを引いている間に腰やもう片方の足に負担がかかっていたまってきた。

健全な体というのは五体万全でないと得られないという教訓ですな。

とにかく杜甫通学、これいずれのひかかえるとしぞ

五言絶句かよ、ああ、かえるばしょなどないのだ、反語はいちおう定石

君笑うなかれ、古来征戦幾人かかえる、混ぜるな危険って感じ、果てのない旅をしているのだ。

関西詩吟文化協会なんてサイトが有るわ、漢詩より琵琶法師の弾き語りを聞きたい気がする。

なんの話だっけ。

トホトホ徒歩ね、徒歩通学ができなくなったので、臨時で車通学を始めたのだけれど、楽すぎてヤバイ。

わりと急激に太っている気がするなぁ。

二年後ぐらいに郊外に移って車で通学ってスタンスにしようかしら。

ホモロジーを利用した組み換えに依存しない、変異導入（タグ導入）法というCas9論文を読んでいたら１つ２つアイデアが浮かんだので、予算とにらめっこして２万円くらいで実験が出来そうとそろばんを叩いて、久しぶりにみっちりDNA作成計画を立てた、楽しい

むかしよりクローニングが格段に簡単になっているから、クローニングで沈没ということはまずなくなってきた。

これがうまくいかなかったら微小相同領域を利用した変異作成法ってのがある

春にこれを試すか。

Cas9・CRISPRの作成プロトコルもCHOPCHOPを使ってきたけど、目的を限定するとEーCRISPはなにげに使える。

１動物種を選び

２Gene symbolで検索

３右に出てくるリストのなかから目的のものをクリック

４sgRNAの選択性のクライテリアを決定する

５検索してみる（Start sgRNA search)

＊Advanced optionがわりとユニーク、後で説明します。

とりあえず検索結果、ドン！

時間が少しかかります、待っている間、気の抜けた（？）英語の諺が楽しめたりします。

実はMediumのクライテリアではめちゃくちゃたくさん出てきてグラフを書いてくれないので（まぁデカいタンパク質だからなぁ）、Strictで再検索してみました。

そうなると全く出てこない、何のためのクライテリアかわからん設定です。

さてもう少し小さいタンパク質にしてみるか、今やりそうにないもの・・・アルツハイマー関連酵素関連（ええい）タンパク質PENENでも潰してみますか。

こんな感じでどの配列がどのExonをターゲットにするか、などわかりやすくはなっています。

パラメータの見方は上の方に書いてあります。

ちょっと知識いるけど。

さて最後にちょっと戻ってE-CRISPの洒落た機能をみてみます。

矢印で示したAdvanced searchをクリック

遺伝子改変について、内因性タンパク質をノックアウトしたり、標識を付けたく思うわけですが、そういう用途に適したｓｇＲＮＡをサジェストしてくれたりするのです。

項目が

Knock-out down

N-terminal tagging

C-terminal tagging

CRISPRi（遺伝子発現抑制）

CRISPRa（遺伝子発現促進）

Knock-outにすると

先ほどとくらべてStart codon直下を狙ってる印象となります。

Nterminal tagging

Knock outより５’側にずれました、うまくフレームが合えばUTRに切断サイトが入っても（多分）OKなはず。

ここまで来たらC末までやりますか

こんな感じで３’にしふと、位置が大きく違うのはSplicing valiantやろか、こいつを作るつもりはないから調べる元気ないな。